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无菌操作台标准操作规程

无菌(fungus)操作台标准操作规程

1.目的:
建立无菌检查的标准操作规程,确保检验结果的准确性。   
2.范围:
适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。超净工作台生物安全柜(Biosafety Cabinet)不同。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染,并不保护工作人员,而生物安全柜是负压系统,能有效保护工作人员。

3.责任:
化验员有责任按本操作规程操作,并对检验结果负责。

4.定义:
无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。

5.内容:
5.1无菌操作设备:
无菌操作室或超净工作台,无菌衣、口罩、帽子、消毒(disinfection)鞋、酒精灯(Alcohol lamp)等。
5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置,局部(part)洁净度100级超净工作(gōng zuò)台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯,操作室或工作台应保持空气正压。
5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角,开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕,同样用2%甲酚或0.1%新洁尔灭溶液擦拭工作台面,用紫外光灯杀菌半小时。
5.1.3无菌室的无菌程度检查:无菌室在消毒处理(chǔ lǐ)后,无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟,在接种室内点燃酒精灯,在酒精灯旁,以无菌操作,将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml,制成平板:在35-37℃预培养48小时,证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个;打开碟盖扣置,平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好,置35-37℃培养48小时,取出检查,3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度,应达到100级(一般用尘埃粒子计数仪),检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个/升;空气流量应控制在0.75-1.0m3/s;细菌菌落数平均<1个,可根据无菌状况定期置换过滤器。
5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5%甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75%酒精棉及拖鞋等。
5.2仪器、用具:
5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平(精度0.1g)、抽滤瓶(500ml)、   三角瓶(100、500 ml)、移液管(1、10ml)、注射器(要求规格)、试管、双碟(9cm)、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花(原棉)、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜(直径约5cm),孔径(aperture)应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。
5.2.2用具的包扎:
5.2.2.1移液管
在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。超净工作台是为了适应现代化工业、光电产业、生物制药以及科研试验等**域对局部工作区域洁净度的需求而设计的。
5.2.2.2试管
在管口塞上纱布棉塞。
5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩
将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋,扎紧袋口,再用牛皮纸包好。
5.2.2.4注射器
洗涤干净的注射器及注射针头装配好后,放入垫有纱布的带盖容器内(饭盒)一层层放好,上面盖上纱布,然后盖上容器的盖子,用牛皮纸包好。
5.2.2.5滤器
将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润,取出后固定在细菌过滤器的滤板(Filter plate)上,滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好,上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿拧太紧,滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎,装妥后放入容器内,再将盛滤器的容器盖好盖子,用牛皮纸包扎。
5.2.3用具的灭菌:
将包扎好的用具,在121±0.5℃蒸汽灭菌柜中灭菌30分钟,物品取出时切勿马上置冷处,以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压,易致染菌,应置温箱或或加温烘干。
5.3培养基、试剂:
5.3.1一般采用商品干燥培养基,临用时按照使用说明书进行配制,需注意培养基的pH值应符合规定,否则**校正后,灭菌使用。
使用前,按要求分装灭菌好的细菌培养基须经30-35℃培养48小时,真菌培养基须经20-25℃培养72小时,证明无菌生长后方可使用。
制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完,在供试品接种前,培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5,否则须经水浴煮沸加热,只限加热一次。
5.3.2革兰氏碘液:
先用3-5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾,再加入1.0g碘片,搅拌溶解后,加蒸馏水稀释**300ml,摇匀。置密闭棕色瓶中备用。
5.3.3结晶紫染色液:
将结紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后,与80ml1%草酸铵溶液相混合,静置48小时使用。超净工作台与生物安全柜(Biosafety Cabinet)不同。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染,并不保护工作人员,而生物安全柜是负压系统,能有效保护工作人员。此液稳定,置密闭的棕色瓶中可储存数月。
5.3.4沙黄染色液:
将0.2g沙黄溶解于10ml95%乙醇中,待完全溶解后再加蒸馏水**100ml。
5.3.5生理盐水:
称取9g氯化钠,加水1000ml溶解,分装后于121±0.5℃湿热灭菌30分钟。供作稀释剂用。
5.3.6 75%乙醇
量取无水乙醇75ml,加水稀释**100ml,摇匀,即得。
5.3.7 0.1%新洁尔灭:
量取5%新洁尔灭20ml,加水稀释**约1000ml,摇匀,即得。
5.4培养基灵敏度检查:
5.4.1新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基,其质量均应符合灵敏度检查要求。
   
  (1)取藤黄微球菌(fungus)[Micrococcus luteus  CMCC(B)  28001]的营养琼脂斜面和白色念珠菌[Candida  albicans  CMCC(F)98001]的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物,分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;取生孢梭菌[Clostridium  sporogenes  CMCC(B)64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物,用灭菌毛细管将其吸**灭菌离心管内,离心,弃去上清液,沉淀菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后,制成1ml中含10-100个菌并计数。
    
  (2)取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物,白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物,取接种**霉菌培养基内,20-25℃用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍稀释,制成1ml中含10-100个菌并计数。
   将藤黄微球菌(fungus)的上述
  (1)或
  (2)的稀释液各1ml,分别接种**每管装量为9ml的需气、厌气菌培养基3管,生孢梭菌的上述
  (1)或
  (2)的稀释液各1ml,分别接种**每管装量为12ml的需气、厌气菌培养基3管,白色念珠菌的上述
  (1)或
  (2)的稀释液各1ml,接种**每管装量为9ml的真菌培养基3管,以未接种的培养基作对照,按规定(guī dìng)的温度培养5天并逐日记录结果。
结果判定:以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长(Grow),即该培养基的灵敏度检查符合要求。
5.4.2配制的培养基应在凉暗处保存,一般不得超过2周,临用前细菌和霉菌(mold)培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时,证明无菌生长后方可使用。
5.4.3需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm,其指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5,否则须经水浴煮沸10分钟,但只限加热一次。
无菌试验培养时间结束时,指示剂氧化层应不超过培养基深度的1/2。
5.5对照用菌液的制备:
5.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。
5.5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus  CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许,接种**营养肉汤培养基内,在30-35℃培养16-18小时后,用灭菌生理盐水稀释成
  1:106
5.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,接种**相同培养基内,在30-35℃培养18-24小时后,用灭菌生理盐水稀释成
  1:106。
5.5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种**真菌培养基内,在20-25℃培养24小时后,用灭菌生理盐水稀释成
  1:105。
5.5.5上述制备的菌液,一般当日使用。
5.6进入无菌室的操作控制要点:
5.6.1根据试验程序,将用具物品搬入缓冲间,打开紫外光灯和空气(Basin air)过滤装置并使其工作1小时以上。
5.6.2操作人员用肥皂水刷洗双手,关闭缓冲间紫外光灯,进入缓冲间内,关闭**层门,用2%来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液洗双手,用消毒毛巾擦干,换上无菌衣、帽、口罩及消毒鞋。
5.6.3关闭无菌室内紫外光灯,进入第二层门并将用具搬**无菌室内,关闭无菌室门。
5.6.4凡进入无菌室后不应再外出取物品,因此,在每次试验中所用物品**计划好,并准备好备用物品。从进入**层门直**无菌室内,随操作人员的进入应喷雾2%来苏尔或0.1 %新洁尔灭溶液。
5.7检查法:
5.7.1无菌检查法包括:直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品;后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。
5.7.2操作时,应先用0.1%新洁尔灭浸泡或擦拭容器表面后,以无菌(意思:没有活菌)的方法取内容物。
5.7.3凡无菌检查中,均应取相应溶剂和稀释剂同法操作控制,作阴性对照。
5.7.4供试品制备:
   用灭菌镊取出注射器,在火焰旁将针芯插入针管并安上针头,盖为橡皮塞时,用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入汲取药液。按规定(guī dìng)须稀释或灭活的供试品,可直接或将瓶内供试液抽出**灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释**规定的体积(volume)和浓度;抽取瓶中内容液体时,应将供试品倒置并使针头在液面下。
5.7.5直接接种法:
按规定量取供试品,以无菌(意思:没有活菌)操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管,其中1管接种金黄色葡萄球菌液1ml,作阳性对照,另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动,使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃、真菌培养基管置20-25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长,如在加入(jiā rù)供试品后,培养基出现浑浊,培养7天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种**同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养,细菌培养2日,真菌培养3日,观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长,或用接种环取培养液涂片,染色,用显微镜观察是否有菌。
5.7.6薄膜过滤法:
将微孔滤膜过滤装置(Apparatus)、抽滤瓶、排气管与真空泵相连,真空泵可置无菌室外。
取规定量供试品,按规定的方法处理后,加入(jiā rù)0.9%无菌氯化钠溶液100ml中,混合后,通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器,减压抽干后,用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次,每次**少100ml,取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培养基中,按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(抗细菌药物(drug),以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗厌氧菌药物,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌药物,以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24-48小时,真菌应在培养24-72小时有菌生长(Grow)。
5.8结果判断:
当阳性对照管显浑浊并确有菌生长,阴性对照管呈阴性时,可根据观察所得的结果判定:如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽浑浊但经证明(zhèng míng)并非有菌生长,均应判为供试品合格;如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长,应重新取2倍量供试品,分别依法复试,除阳性对照管外,其他各管均不得有菌生长,否则应判为供试品不合格。

6培训
6.1培训(作用:常识传递、技能传递、标准传递)对象:化验员。
6.2培训时间:二小时。

7记录
     记录(jì lù)名称               保存部门               保存时间
   无菌检验记录              质监科            药品有效期后一年

QF-01-007-00
无菌(意思:没有活菌)检验记录
品   名:                      批   号:                                                   
规   格:                      检验日期:        年     月     日
培养基名称
需气、厌气菌培养基
真菌培养基


培养温度
30―35℃
20―25℃
培养时间


管   号
1
2
3
4
5

1
2
3
4
5

培养天数及结果(result)
1












2












3












4












5












6












7












结  论

备  注

 复核人:                               检验人:

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